中 華 人 民 共 和 國 國 家 標 準
GB 5413.25—2010
中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部 發(fā)布
2010-03-26 發(fā)布 2010-06-01 實施
食品安全國家標準
嬰幼兒食品和乳品中肌醇的測定
National food safety standard
Determination of inositol in foods for infants and young children,
milk and milk products
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GB 5413.25—2010
I
前 言
本標準代替GB/T 5413.25-1997《嬰幼兒配方食品和乳粉 肌醇的測定》。
本標準與GB/T 5413.25-1997相比，第一法主要變化如下：
——對菌種保藏培養(yǎng)基進行了糾正；
——試樣處理由鹽酸蒸餾法改為鹽酸高壓水解法；
——菌種接種方式由菌液與培養(yǎng)基混合后分裝試管改為菌液向試管中滴加法；
——對標準工作溶液的濃度做了調整；
——滅菌溫度由100 ℃調整為121 ℃；
——明確了控制接種菌懸液濃度的要求和方法；
——提高了計算公式的適用性；
——增加了檢出限。
第二法主要變化如下：
——采用肌醇硅烷化衍生法；
——增加了檢出限。
本標準的附錄A和附錄Ｂ為資料性附錄。
本標準所代替標準的歷次版本發(fā)布情況為：
——GB 5413-1985、 GB/T 5413.25-1997。
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GB 5413.25—2010
1
食品安全國家標準
嬰幼兒食品和乳品中肌醇的測定
1 范圍
本標準規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中肌醇的測定方法。
本標準適用于嬰幼兒食品和乳品中肌醇的測定。
2 規(guī)范性引用文件
本標準中引用的文件對于本標準的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版
本適用于本標準。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標準。
第一法 微生物法
3 原理
利用葡萄汁酵母菌（Saccharomyces uvarum）對肌醇的特異性和靈敏性，定量測定出試樣中待測
物質的含量。在含有除待測物質以外所有營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中，微生物的生長與待測物質含量呈線性
關系，根據(jù)透光率與標準工作曲線進行比較，即可計算出試樣中待測物質的含量。
4 試劑和材料
除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的二級水。
4.1 菌株：葡萄汁酵母菌（Saccharomyces uvarum）， ATCC 9080。
4.2 肌醇（myo-Inositol）標準品：分子式 C6H12O6，純度≥99 %。
4.3 氯化鈉（NaCl）。
4.4 氫氧化鈉（NaOH）。
4.5 培養(yǎng)基
4.5.1 麥芽浸粉瓊脂培養(yǎng)基（Malt Extract Agar）：參見附錄 A。
4.5.2 肌醇測定培養(yǎng)基：參見附錄 A。
4.6 氯化鈉溶液（9 g/L）：稱取 9.0 g 氯化鈉溶解于 1000 mL 水中，分裝試管，每管 10 mL。 121℃
滅菌 15 min。
4.7 鹽酸（1 mol/L）：量取 82.0 mL 鹽酸溶于水中，冷卻后定容至 1000 mL。
4.8 鹽酸（0.44 mol/L）：量取 36.6 mL 鹽酸溶于水中，冷卻后定容至 1000 mL。
4.9 氫氧化鈉溶液（600 g/L）：稱取 300 g 氫氧化鈉溶解于水中，冷卻后定容至 500 mL。
4.10 氫氧化鈉溶液（1 mol/L）：稱取 40 g 氫氧化鈉溶解于水中，冷卻后定容至 1000 mL。
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2
4.11 肌醇標準溶液
4.11.1 肌醇標準貯備液（0.2 mg/mL）：肌醇標準品置于裝有五氧化二磷的干燥器中干燥 24 h 以上，
稱取 50 mg 肌醇標準品（4.2）（精確到 0.1 mg），用水充分溶解，定容至 250 mL，貯存于冰箱中。
4.11.2 肌醇標準中間液（10 μg/mL）：吸取 5 mL 肌醇標準貯備液（4.11.1）用水定容到 100 mL，
貯存于冰箱。
4.11.3 肌醇標準工作液（1 μg/mL 和 2 μg/mL）：吸取 10 mL 肌醇標準中間液（4.11.2）兩次，分別
用水定容到 100 mL 和 50 mL。該工作液需每次臨用前配制。
4.12 干燥劑：五氧化二磷（P2O5）。
4.13 玻璃珠：直徑約 5 mm。
5 儀器和設備
除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下：
5.1 天平：感量為 0.1 mg。
5.2 pH 計：精度≤0.02。
5.3 分光光度計。
5.4 渦旋混合器。
5.5 離心機：轉速≥2000 轉/分鐘。
5.6 恒溫培養(yǎng)箱： 30 ℃ ±1 ℃。
5.7 振蕩培養(yǎng)箱： 30 ℃ ±1 ℃，振蕩速度 140 次/min～160 次/min。
5.8 冰箱： 2 ℃～5 ℃。
5.9 無菌吸管： 10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器或吸頭。
5.10 瓶口分液器： 0 mL～10 mL。
5.11 錐形瓶： 200 mL。
5.12 容量瓶（A 類）： 100 mL ， 250 mL， 500 mL。
5.13 單刻度移液管（A 類）：容量 5 mL。
5.14 漏斗：直徑 90 mm。
5.15 定量濾紙：直徑 90 mm。
5.16 試管： 18 mm ×180 mm。
注： 玻璃儀器使用前，用活性劑對硬玻璃測定管及其他必要的玻璃器皿進行清洗，清洗之后在 200 ℃干熱 2 h。
6 分析步驟
6.1 接種菌懸液的制備
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3
6.1.1 菌種復蘇
將菌株（4.1）活化后接種到麥芽浸粉瓊脂斜面培養(yǎng)基（4.5.1）上， 30 ±1 ℃ ℃ 培養(yǎng) 16 h～24 h 后，
再轉接 2 代～3 代來增強活力，制成貯備菌種，貯于冰箱（8.5）中，保存期不要超過 2 周。臨用前接
種到新的麥芽浸粉瓊脂斜面培養(yǎng)基上。
6.1.2 接種菌懸液的制備
在使用的前一天將貯備菌種轉接到新配制的麥芽浸粉瓊脂斜面培養(yǎng)基上，于 30 ℃±1 ℃ 培養(yǎng) 16
h～24 h。用接種環(huán)刮取菌苔到一支滅菌氯化鈉溶液（4.6）試管中。以 2000 轉/分鐘離心 2 min～3 min，
傾出上清液，加入 10 mL 氯化鈉溶液（4.6），振蕩混勻，再離心 2 min～3 min，如此清洗 3 次～4 次。
吸取一定量的該菌液移入裝有 10 mL 氯化鈉溶液（4.6）的試管中，制成接種菌懸液。
用分光光度計，以氯化鈉溶液（4.6）作空白， 550 nm 波長下測定該接種菌懸液的透光率，調整
加入的菌液量或者加入一定量的氯化鈉溶液使該菌懸液透光率在 60 %～80 %。
6.2 試樣的處理
6.2.1 稱取約含肌醇 0.5 mg～2.0 mg 的試樣（精確至 0.1 mg）于 250 mL 三角瓶中，對于干粉試樣加
入 80 mL 鹽酸（4.8），對于液體試樣加入 100 mL 鹽酸（4.8），混勻，使干粉試樣溶解。
6.2.2 將三角瓶以鋁箔紙覆蓋，在滅菌釜中 125 ℃ 消化 1 h。取出，冷卻至室溫，加入約 2 mL 氫氧
化鈉溶液（4.9），冷卻。用氫氧化鈉溶液（4.10）或鹽酸溶液（4.7）調 pH 至 5.2，轉入 250 mL 容量
瓶中，定容至刻度�；靹�，過濾，收集濾液，該濾液為待測液。調整稀釋度，使待測液肌醇的濃度在
1 μg/mL～10 μg/mL 范圍內。
6.3 標準曲線的制作
按表 1 順序加入蒸餾水、肌醇標準工作液（4.11.3）和肌醇測定培養(yǎng)基（4.5.2）于培養(yǎng)管中，一式
三份。
表1 標準曲線的制作

試管號	S1	S2	S3	S4	S5	S6	S7	S8	S9	S10
蒸餾水（mL）	5	5	4	3	2	1	0	2	1	0
肌醇標準工作液 1 μg/mL（mL）	0	0	1	2	3	4	5	0	0	0
肌醇標準工作液 2 μg/mL（mL）	0	0	0	0	0	0	0	3	4	5
培養(yǎng)基（mL）	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5

6.4 待測液的制作
按表 2 順序加入蒸餾水、待測液（6.2.2）和肌醇測定培養(yǎng)基（4.5.2）于培養(yǎng)管中，一式三份。
表2 待測液的制作

試管號	1	2	3	4
蒸餾水（mL）	4	3	2	1
待測液（mL）	1	2	3	4
培養(yǎng)基（mL）	5	5	5	5

6.5 滅菌
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每支試管內加入一粒玻璃珠（4.13），蓋上試管帽， 121 ℃ 滅菌 5 min（商品培養(yǎng)基按標簽說明進
行滅菌）。
6.6 接種
將上述試管迅速冷卻至 30 ℃ 以下。用滴管或移液器向上述試管中各滴加一滴（約 50 μL）接種菌
懸液（6.1.2），其中標準曲線管中的接種空白試管 S1 除外。
6.7 培養(yǎng)
將試管固定在振蕩培養(yǎng)箱內，用約 140 次/min～160 次/min 的振蕩速度，在 30 ℃ ±1 ℃ 振蕩培養(yǎng)
22 h～24 h。
6.8 測定
對每支試管進行視覺檢查，接種空白試管 S1 內培養(yǎng)液應是澄清的，如果出現(xiàn)渾濁，則結果無效。
6.8.1 從振蕩培養(yǎng)箱內取出試管，放入滅菌釜內， 100 ℃ 保持 5 min，使微生物停止生長。
6.8.2 用接種空白試管 S1（6.3）作空白，將分光光度計透光率調到 100 %（或吸光度 A 為 0），讀
出接種空白試管 S2（6.3）的讀數(shù)。再以接種空白試管 S2 為空白，調節(jié)透光率為 100 %（或 A 為 0），
依次讀出其他每支試管的透光率（或吸光度 A）。
6.8.3 用渦旋混合器充分混合每一支試管（也可以加一滴消泡劑）后，立即將培養(yǎng)液移入比色皿內進
行測定，波長為 540 nm～660 nm，待讀數(shù)穩(wěn)定 30 s 后，讀出透光率，每支試管穩(wěn)定時間要相同。以肌
醇標準品的含量為橫坐標，透光率為縱坐標作標準曲線。
6.8.4 根據(jù)待測液的透光率，從標準曲線中查得該待測液中肌醇的濃度，再根據(jù)稀釋因子和稱樣量計
算出試樣中肌醇的含量。透光率超出標準曲線管 S3～S10 范圍的試樣管要舍去。
6.8.5 對每個編號的待測液的試管，用每支試管的透光率計算每毫升該編號待測液肌醇的濃度，并計
算該編號待測液的肌醇濃度平均值，每支試管測得的該濃度不得超過該平均值的±15 %，超過者要舍
去。如果符合該要求的管數(shù)少于所有的四個編號的待測液的總管數(shù)的 2/3，用于計算試樣含量的數(shù)據(jù)
是不充分的, 需要重新檢驗。如果符合要求的管數(shù)超過原來管數(shù)的 2/3，重新計算每一編號的有效試樣
管中每毫升測定液肌醇含量的平均值，以此平均值計算全部編號試樣管的總平均值 Cx，用于計算試樣
中的肌醇含量。
注： 繪制標準曲線，既可讀取透光率（T %），也可讀取吸光度（A）。
7 分析結果的表述
試樣中肌醇的含量按式(1)計算：
100
1000
= × ×
f
Cm
X x ………………………………………………………………(1)
式中：
X——試樣中肌醇的含量，單位為毫克每百克（mg/100 g）；
Cx——6.8.5 中計算所得的總平均值，單位為微克（μg）；
m——試樣的質量，單位為克（g）；
f ——稀釋倍數(shù)。嬰幼兒食品和乳品 f 為 250。
以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術平均值表示，結果保留三位有效數(shù)字。
8 精密度
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在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10 %。
第二法 氣相色譜法
9 原理
試樣中的肌醇用水和乙醇提取后，與硅烷化試劑衍生，正己烷提取，經(jīng)氣相色譜分離，外標法定
量。
10 試劑和材料
除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的一級水。
10.1 無水乙醇(C2H6O)。
10.2 正己烷(C6H14)。
10.3 乙醇（95 %）。
10.4 乙醇（70 %）。
10.5 三甲基氯硅烷(C3H9ClSi)。
10.6 六甲基二硅胺烷(C6H19NSi2)。
10.7 N， N-二甲基甲酰胺(C3H7NO)。
10.8 硅烷化試劑：分別吸取體積比為 1： 2： 8 的三甲基氯硅烷、六甲基二硅胺烷、 N， N-二甲基甲
酰胺，超聲混勻，臨用前配制。
10.9 肌醇標準品：純度≥99 %。
10.10 肌醇標準溶液（0.010 mg/mL）：稱取 100 mg（精確至 0.1 mg）經(jīng)過 105 ±1 ℃ ℃ 烘干 2 h 的
肌醇標準品（10.9）于 100 mL 容量瓶中，用 25 mL 水溶解完全。用乙醇（10.3）定容至刻度，混勻。
取 1 mL 此溶液于 100 mL 容量瓶中，用乙醇（10.4）定容至刻度，混勻。
11 儀器和設備
11.1 天平：感量為 0.1 mg。
11.2 氣相色譜儀，帶 FID 檢測器。
11.3 離心機：轉速≥5000 轉/分鐘。
11.4 旋轉蒸發(fā)儀。
11.5 超聲波清洗器。
11.6 恒溫熱水浴槽。
11.7 帶有羅紋蓋的 25 mL 試管。
12 分析步驟
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12.1 試樣處理與衍生
12.1.1 試樣處理： 固體試樣混合均勻后稱取 1 g（精確至 0.0001 g） ， 于 50 mL 容量瓶中， 加入 12 mL
約 40 ℃ 溫水溶解試樣；液體試樣直接稱取 12 g（精確至 0.0001 g）于 50 mL 容量瓶中。上述試樣超聲
提取約 10 min，用乙醇（10.3）定容至刻度，混勻。靜置約 20 min 后，取 10 mL 于 15 mL 離心管中，
以不低于 4000 轉/分鐘離心約 5 min。取上清液 5 mL 于旋轉蒸發(fā)儀濃縮瓶中。
12.1.2 干燥與衍生：向濃縮瓶中加入 10 mL 無水乙醇（10.1），在 80 ℃ ±2 ℃ 下旋轉濃縮至近干時
再加入 5mL 無水乙醇（10.1）繼續(xù)濃縮至徹底干燥（有水將使下步硅烷化不徹底）。加入硅烷化試劑
（10.8） 10 mL，超聲溶解 5 min 并轉移至 25 mL 有螺紋蓋的離心管中，放于 80 ℃ ±2 ℃ 水浴中衍生反
應約 75 min，期間每隔約 20 min 取出震蕩一次，然后取出冷卻至室溫。加入 5mL 正己烷（10.2），振
蕩混合后靜止分層。取上層液 3 mL 于預先加少許無水硫酸鈉的帶螺紋蓋離心管中，振蕩后以不低于
4000 轉/分鐘離心，此為試樣測定液。
12.2 標準測定液的制備
分別吸取 0.0 mL， 2.0 mL， 4.0 mL， 6.0 mL， 8.0 mL， 10.0 mL 肌醇標準溶液（10.10）于濃縮瓶
中，按 12.1.2 步驟操作。
12.3 測定
12.3.1 參考色譜條件
色譜柱：填料為 50 %氰丙基-甲基聚硅氧烷的毛細管柱（柱長 60 m, 內徑 0.25 mm，膜厚 0.25 μm）
或同等性能的色譜柱。
進樣口溫度： 280 ℃ 。
檢測器溫度： 300 ℃ 。
分流比： 10： 1。
進樣量： 1.0 μL。
程序升溫見表 3：
表 3 程序升溫

升溫速率（℃ / min）	溫度（℃ ）	持續(xù)時間（min）
120	0
10	190	50
10	220	3

12.3.2 標準曲線制作
分別將標準溶液測定液（12.2）注入到氣相色譜儀中（色譜圖參見附錄 B），以測得的峰面積（或
峰高）為縱坐標，以肌醇標準測定液中肌醇的含量為橫坐標制作標準曲線。
12.3.3 試樣溶液的測定
分別將試樣測定液（12.1.2）注入到氣相色譜儀中得到峰面積（或峰高），從標準曲線中獲得試樣
測定液中肌醇的含量（mg）。
13 分析結果的表述
試樣中肌醇含量按式(2)計算：
= × ×100
i
s i
m
C f
X …………………………………………………………………(2)
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7
式中：
X——試樣中肌醇含量，單位為毫克每百克（mg/100 g）；
Cs——從標準曲線中獲得試樣測定液肌醇的含量，單位為毫克（mg）。
mi——試樣的質量，單位為克（g）。
fi——試樣測定液所含肌醇換算成試樣中所含肌醇的系數(shù)為 10。
以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術平均值表示，結果保留三位有效數(shù)字。
14 精密度
在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10 %。
15 其他
本標準第一法、第二法檢出限均為 2.0 mg/100 g。
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附錄 A
（規(guī)范性附錄）
培養(yǎng)基和試劑
A.1 麥芽浸粉瓊脂培養(yǎng)基（Malt Extract Agar）
A.1.1 成分
麥芽糖 12.75 g， 糊精 2.75 g， 丙三醇 2.35 g， 蛋白胨 0.78 g， 瓊脂 15.0 g， 蒸餾水 1000 mL， pH 4.7±0.2
(25 ±5 ℃ ℃ )。
A.1.2 制法
先將除瓊脂以外的其他成分溶解于蒸餾水中，調節(jié) pH，再加入瓊脂，加熱煮沸，使瓊脂溶化�；�
合均勻后分裝試管，每管 10 mL。 121 ℃ 高壓滅菌 15 min，擺成斜面?zhèn)溆谩?br /> A.2 肌醇測定培養(yǎng)基
A.2.1 成分
葡萄糖 100 g，檸檬酸鉀 10 g，檸檬酸 2 g，磷酸二氫鉀 1.1 g，氯化鉀 0.85 g，硫酸鎂 0.25 g，氯
化鈣 0.25 g，硫酸錳 50 mg，氯化亞鐵 50 mg， DL-色氨酸 80 mg， L-胱氨酸 0.1 g， L-異亮氨酸 0.5 g，
L-亮氨酸 0.5 g ， L-賴氨酸 0.5 g， L-蛋氨酸 0.2 g， DL-苯基丙氨酸 0.2 g， L-酪氨酸 0.2 g， L-天門冬氨
酸 0.8 g， DL-天門冬氨酸 0.2 g， DL-絲氨酸 0.1 g，甘氨酸 0.2 g， DL-蘇氨酸 0.4 g， L-纈氨酸 0.5 g，
L-組氨酸 0.124 g， L-脯氨酸 0.2 g， DL-丙氨酸 0.4 g， L-谷氨酸 0.6 g， L-精氨酸 0.48 g，鹽酸硫胺素 500
μg，生物素 16 μg，泛酸鈣 5 mg，鹽酸吡哆醇 1 mg，蒸餾水 1000 mL， pH 5.2±0.2（25 ±5 ℃ ℃ ）。
A.2.2 制法
將上述成分溶解于水中，調節(jié) pH，備用。
注： 一些商品化合成培養(yǎng)基效果良好，商品化合成培養(yǎng)基按標簽說明進行配制。
 
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