- 定做培養(yǎng)基/定制培養(yǎng)基
- 顆粒培養(yǎng)基
- 標(biāo)準(zhǔn)菌株生化鑒定試劑盒
- 預(yù)灌裝即用型成品培養(yǎng)基
- 2025年版中國(guó)藥典
- 促銷/特價(jià)商品
- 院感/疾控/體外診斷/采樣管
- 樣品采集與處理(均質(zhì))產(chǎn)品
- 按標(biāo)準(zhǔn)檢索培養(yǎng)基
- 模擬灌裝用培養(yǎng)基
- 干燥粉末培養(yǎng)基
- 培養(yǎng)基添加劑/補(bǔ)充劑
- 生化反應(yīng)鑒定管
- 染色液等配套產(chǎn)品
- 對(duì)照培養(yǎng)基/標(biāo)準(zhǔn)品
- 實(shí)驗(yàn)耗材與器具
- 生化試劑/化學(xué)試劑
- 菌種鑒定服務(wù)
GB/T 4789
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GB/T 4789.30-2025 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)
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中 華 人 民 共 和 國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn)
GB 4789.30—2025
食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗(yàn)
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)
2025-03-16 發(fā)布 2025-09-16 實(shí)施
中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)
國(guó) 家 市 場(chǎng) 監(jiān) 督 管 理 總 局 發(fā) 布
前 言
本標(biāo)準(zhǔn)與 GB4789.30—2016 相比, 主要變化如下:
———修改了適用范圍;
———修改了培養(yǎng)基和試劑, 增加了 OA 李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基配方;
———修改了第一法 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)增菌液、 選擇性培養(yǎng)基、 檢驗(yàn)程序、 鑒定方
法等;
———修改了第二法 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法的樣品接種、 菌落計(jì)數(shù)和確認(rèn)、 結(jié)果計(jì)
數(shù)、 結(jié)果報(bào)告;
———修改了第三法 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌 MPN 計(jì)數(shù)法的樣品接種。
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GB 4789.30—2025
食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗(yàn)
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)
1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes ) 的檢驗(yàn)方法。
本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的定性檢驗(yàn); 第二法適用于單核細(xì)胞增生李
斯特氏菌含量較高的食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的計(jì)數(shù); 第三法適用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌
含量較低的食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的計(jì)數(shù)。
2 設(shè)備和材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外, 其他設(shè)備和材料如下。
2.1 冰箱:2 ℃ ~8 ℃ 。
2.2 恒溫培養(yǎng)箱:30 ℃ ±1 ℃ 、36 ℃ ±1 ℃ 、25 ℃ ~30 ℃ 。
2.3 均質(zhì)器。
2.4 顯微鏡:100 × ~1 000 × 。
2.5 電子天平: 感量為0.1 g、0.1 mg。
2.6 錐形瓶:100 mL、500 mL。
2.7 無(wú)菌吸管:1 mL( 具0.01 mL 刻度) 、10 mL( 具0.1 mL 刻度) 或移液器( 量程為0.1 mL、1 mL、
10 mL) 及無(wú)菌吸頭。
2.8 無(wú)菌培養(yǎng)皿: 直徑90 mm。
2.9 無(wú)菌試管:16 mm × 160 mm。
2.10 離心機(jī):4 000 r/min。
2.11 無(wú)菌離心管:30 mm × 100 mm。
2.12 無(wú)菌注射器:1 mL。
2.13 油鏡或相差顯微鏡。
2.14 無(wú)菌涂布棒。
2.15 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes )ATCC 19111 或 CMCC 54004 或其他等效
菌株。
2.16 英諾克李斯特氏菌(Listeriainnocua )ATCC33090 或其他等效菌株。
2.17 伊氏李斯特氏菌(Listeriaivanovii )ATCC19119 或其他等效菌株。
2.18 斯氏李斯特氏菌(Listeriaseeligeri )ATCC35967 或其他等效菌株。
2.19 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )ATCC25923 或其他等效菌株, 要求產(chǎn)β-溶血環(huán)。
2.20 馬紅球菌(Rhodococcus equi )ATCC6939 或 NCTC1621 或其他等效菌株。
2.21 小鼠:ICR 品系, 體重18 g~22 g。
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GB 4789.30—2025
2.22 微生物生化鑒定系統(tǒng)。
2.23 無(wú)菌過(guò)濾裝置。
3 培養(yǎng)基和試劑
3.1 含0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆肉湯(TSB-YE) : 見(jiàn)附錄 A 中 A.1。
3.2 含0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE) : 見(jiàn) A.2。
3.3 Fraser 增菌肉湯(FB1 、FB2 ) : 見(jiàn) A.3。
3.4 OA 李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基: 見(jiàn) A.4。
3.5 PALCAM 培養(yǎng)基: 見(jiàn) A.5。
3.6 革蘭氏染色液: 見(jiàn) A.6。
3.7 SIM 動(dòng)力培養(yǎng)基: 見(jiàn) A.7。
3.8 緩沖葡萄糖蛋白胨水[甲基紅(MR) 和乙酰甲基醇(VP) 試驗(yàn)用]: 見(jiàn) A.8。
3.9 羊血瓊脂: 見(jiàn) A.9。
3.10 無(wú)菌磷酸鹽緩沖液: 見(jiàn) A.10。
3.11 無(wú)菌生理鹽水: 見(jiàn) A.11。
3.12 糖發(fā)酵管: 見(jiàn) A.12。
3.13 過(guò)氧化氫試劑: 見(jiàn) A.13。
3.14 微生物生化鑒定試劑盒。
第一法 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)
4 檢驗(yàn)程序
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖1。
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GB 4789.30—2025
圖1 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)程序
5 操作步驟
5.1 增菌
以無(wú)菌操作取25 g (mL) 樣品, 置于盛有225 mL FB1 增菌肉湯的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi),8 000 r/min~
10 000 r/min 均質(zhì)1 min~2 min, 或放入盛有225 mL FB1 增菌肉湯的無(wú)菌均質(zhì)袋中, 用拍擊式均質(zhì)器
拍打1 min~2 min, 制成1∶ 10 的樣品勻液。 若樣品為液態(tài), 也可采用振蕩或攪拌混勻。 于30 ℃ ±1 ℃
培養(yǎng)24 h±2 h。 混勻, 吸取0.1 mL FB1 增菌肉湯, 轉(zhuǎn)種于10 mL FB2 增菌肉湯內(nèi)。 于30 ℃ ±1 ℃ 培
養(yǎng)24 h±2 h。
5.2 分離
取混勻后的 FB2 增菌肉湯, 分別接種于 OA 李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基(或其他等效李斯特氏菌顯色
培養(yǎng)基) 平板和 PALCAM 培養(yǎng)基平板,36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)24 h~48 h, 觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落。 典
型菌落在 OA 李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基平板上形成直徑為1 mm~3 mm 的圓形藍(lán)綠色菌落, 周?chē)胁煌?br /> 3
GB 4789.30—2025
明的暈圈。 典型菌落在 PALCAM 培養(yǎng)基平板上形成直徑為1 mm~3 mm 的圓形灰綠色菌落, 周?chē)?br /> 棕黑色水解圈, 培養(yǎng)48 h 后, 部分菌落中心形成黑點(diǎn)且有凹陷。 其他等效李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基平板
上的菌落特征參照產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行判定。
注1 : 一些單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在 OA 李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上的菌落周?chē)臅炄Σ幻黠@甚至沒(méi)有暈圈。 還
有一些單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在 OA 李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上的菌落周?chē)臅炄Τ霈F(xiàn)得比較遲緩, 有時(shí)
需要4d 以上才出現(xiàn)。
注2: 伊氏李斯特氏菌在 OA 李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)與單核細(xì)胞增生李斯特氏菌相似。
5.3 純培養(yǎng)
從每個(gè)平板(符合5.2 要求的平板) 中挑取3 個(gè)~5 個(gè)典型或可疑菌落(少于3 個(gè)全選) , 在 TSA-YE
平板或羊血平板上劃線, 于36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)18 h~24 h。 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在 TSA-YE 平板或
羊血平板上, 呈灰白色, 半透明, 邊緣整齊, 露滴狀菌落、 直徑為1 mm~2 mm。
5.4 初步鑒定
挑取 TSA-YE 平板或羊血平板上的單個(gè)菌落, 接種木糖、 鼠李糖發(fā)酵管, 于36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)24 h±
2 h; 同時(shí)在 TSA-YE 平板或羊血平板上劃線, 于36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)18 h~24 h, 以獲取下一步鑒定用的
純培養(yǎng)物。 然后選擇木糖陰性, 鼠李糖陽(yáng)性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行鑒定。
5.5 鑒定
注: 可先從每個(gè)平板(符合5.2 要求的平板) 中挑取1 株菌進(jìn)行鑒定試驗(yàn), 如果鑒定為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌, 可
直接按6 結(jié)果與報(bào)告的規(guī)定報(bào)告檢出結(jié)果; 按5.3 要求挑取的3 個(gè)~5 個(gè)典型或可疑菌落(少于3 個(gè)全選) 均鑒
定為非單核細(xì)胞增生李斯特氏菌后方可報(bào)告未檢出的結(jié)果。
5.5.1 鏡檢: 挑取18 h~24 h 純培養(yǎng)的單個(gè)菌落做革蘭氏染色鏡檢, 李斯特氏菌為革蘭氏陽(yáng)性短桿菌,
大小為(0.4 μm~0.5 μm) × (0.5 μm~2.0 μm) 。 用生理鹽水制成菌懸液, 在油鏡或相差顯微鏡下觀察,
該菌出現(xiàn)輕微旋轉(zhuǎn)或翻滾樣的運(yùn)動(dòng)。
5.5.2 動(dòng)力試驗(yàn): 挑取18 h~24 h 純培養(yǎng)的單菌落穿刺半固體或SIM 動(dòng)力培養(yǎng)基, 于25 ℃ ~30 ℃ 培
養(yǎng)48 h±2 h。 李斯特氏菌沿穿刺線以不規(guī)則的云霧狀向四周延伸生長(zhǎng), 培養(yǎng)基表面下3 mm~5 mm
處形成一似傘狀(或梭狀) 界面。 如傘狀( 或梭狀) 生長(zhǎng)不明顯, 可繼續(xù)培養(yǎng), 每天觀察結(jié)果1 次, 觀察
5 d。
5.5.3 生化鑒定: 挑取18 h~24 h 純培養(yǎng)的單個(gè)菌落, 進(jìn)行過(guò)氧化氫酶試驗(yàn), 過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性反應(yīng)的菌
落繼續(xù)進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)、MR-VP 試驗(yàn)。 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的主要生化特征見(jiàn)表1。
5.5.4 溶血試驗(yàn): 將新鮮的羊血瓊脂平板底面劃分為20 個(gè)~25 個(gè)小格, 挑取18 h~24 h 純培養(yǎng)的單個(gè)
菌落刺種到血平板上, 每格刺種1 個(gè)菌落, 并刺種陽(yáng)性對(duì)照菌(單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、 伊氏李斯特氏
菌和斯氏李斯特氏菌) 和陰性對(duì)照菌(英諾克李斯特氏菌) , 穿刺時(shí)盡量接近底部, 但不要觸到底面, 同時(shí)
避免瓊脂破裂,36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)24 h~48 h, 于明亮處觀察, 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌呈現(xiàn)狹窄、 清晰、
明亮的溶血圈, 斯氏李斯特氏菌在刺種點(diǎn)周?chē)a(chǎn)生狹窄、 微弱的溶血環(huán), 英諾克李斯特氏菌無(wú)溶血環(huán), 伊
氏李斯特氏菌產(chǎn)生寬的、 輪廓清晰的β-溶血區(qū)域。
5.5.5 協(xié)同溶血試驗(yàn) CAMP(可選項(xiàng)目) : 在羊血瓊脂平板上平行劃線接種金黃色葡萄球菌和馬紅球
菌, 挑取18 h~24 h 純培養(yǎng)的單個(gè)菌落垂直劃線接種于平行線之間, 垂直線兩端不要觸及平行線, 距離
1 mm~2 mm, 同時(shí)接種單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、 英諾克李斯特氏菌、 伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特
氏菌, 于36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)24 h~48 h。 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在靠近金黃色葡萄球菌處出現(xiàn)約
2 mm 的β-溶血增強(qiáng)區(qū)域, 斯氏李斯特氏菌也出現(xiàn)微弱的溶血增強(qiáng)區(qū)域, 伊氏李斯特氏菌在靠近馬紅球
菌處出現(xiàn)5 mm~10 mm 的“箭頭狀”β-溶血增強(qiáng)區(qū)域, 英諾克李斯特氏菌不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。 若結(jié)果不
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GB 4789.30—2025
明顯, 可置2 ℃ ~8℃ 冰箱24 h~48 h 再觀察。
注: 有5% ~8% 的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌可在馬紅球菌一端形成輕微溶血增強(qiáng)(約1 mm) 現(xiàn)象, 此現(xiàn)象不屬于
溶血增強(qiáng)的情況。
表1 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌主要鑒定特征及與其他李斯特氏菌的區(qū)別
如選擇生化鑒定試劑盒或微生物生化鑒定系統(tǒng), 可不經(jīng)5.4 初步鑒定, 直接從 TSA-YE 平板或羊血
平板上挑取可疑菌落, 用生理鹽水制備成濁度適當(dāng)?shù)木鷳乙?/span>, 使用微生物生化鑒定試劑盒或微生物生化
鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。
5.6 小鼠毒力試驗(yàn)(可選項(xiàng)目)
將符合上述特性的純培養(yǎng)物接種于 TSB-YE 中, 于36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)24 h,4000r/min 離心5 min,
棄上清液, 用無(wú)菌生理鹽水制備成濃度為1010 CFU/mL 的菌懸液, 取此菌懸液對(duì)3 只~5 只小鼠進(jìn)行
腹腔注射, 每只0.5 mL, 同時(shí)觀察小鼠死亡情況。 小鼠于2 d~5 d 內(nèi)死亡者為致病株。 試驗(yàn)設(shè)單核細(xì)
胞增生李斯特氏菌致病株和無(wú)菌生理鹽水對(duì)照組。 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、 伊氏李斯特氏菌對(duì)小鼠
有致病性。
6 結(jié)果與報(bào)告
綜合5.4、5.5 鑒定結(jié)果, 報(bào)告25 g(mL) 樣品中檢出或未檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。 25 g(mL)
樣品中未檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌也可報(bào)告為0/25 g(mL) 。
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第二法 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法
7 檢驗(yàn)程序
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)程序見(jiàn)圖2。
圖2 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)程序
8 操作步驟
8.1 樣品的稀釋
8.1 .1 以無(wú)菌操作取25 g(mL) 樣品, 置于盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或無(wú)添加劑的Fraser 增菌肉湯的
無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi),8 000r/min~10 000r/min 均質(zhì)1 min~2 min, 或放入盛有225 mL 上述稀釋液的無(wú)菌
均質(zhì)袋中, 用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min~2 min, 制成1∶ 10 的樣品勻液。 若樣品為液態(tài), 也可采用振蕩
或攪拌混勻, 制成1∶ 10 的樣品勻液。
8.1 .2 用1 mL 無(wú)菌吸管或移液器吸取1∶ 10 樣品勻液1 mL, 沿管壁緩慢注于盛有9 mL 磷酸鹽緩沖
液或無(wú)添加劑的 Fraser 增菌肉湯的無(wú)菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面) , 充分混勻,
制成1∶ 100 的樣品勻液。
8.1 .3 按8.1.2 操作程序, 制備10 倍系列稀釋樣品勻液。 每遞增稀釋1 次, 換用1 支1 mL 無(wú)菌吸管或
吸頭。
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8.2 樣品的接種
8.2.1 根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì), 選擇2 個(gè)~3 個(gè)適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液( 液體樣品可包括原
液) , 每個(gè)稀釋度分別吸取0.1mL 樣品勻液, 接種1 個(gè) OA 李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基( 或其他等效的李斯
特氏菌顯色培養(yǎng)基) 平板。 并用無(wú)菌涂布棒涂布整個(gè)平板, 注意不要觸及平板邊緣。 使用前, 如瓊脂平
板表面有水珠, 可放在25 ℃ ~50 ℃ 的培養(yǎng)箱里干燥, 直到平板表面的水珠消失。
注: 必要時(shí), 每個(gè)稀釋度可做重復(fù)試驗(yàn)。
8.2.2 對(duì) 于 單 核 細(xì) 胞 增 生 李 斯 特 氏 菌 含 量 較 低 的 食 品 樣 品, 吸 取 1mL 最 低 稀 釋 度 樣 品 勻 液, 以
0.3 mL、 0.3 mL、0.4 mL 的接種量分別涂布于3 塊 OA 李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基(或其他等效的李斯特
氏菌顯色培養(yǎng)基) 平板。 涂布方法同8.2.1。
8.2.3 從樣品稀釋至樣品接種完畢不得超過(guò)45 min。
8.3 培養(yǎng)
8.3.1 通常情況下, 涂布后, 將平板正置于水平桌上10 min~20 min 后翻轉(zhuǎn)平皿, 放入培養(yǎng)箱培養(yǎng),
36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)24 h~48 h。
8.3.2 如果樣液不易吸收, 可將平板正置在培養(yǎng)箱36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)1 h, 等樣品勻液吸收后再翻轉(zhuǎn)平
皿, 倒置于培養(yǎng)箱,36 ℃ ±1 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)24 h~48 h。
8.4 典型菌落計(jì)數(shù)和確認(rèn)
8.4.1 選擇有典型或可疑單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌落生長(zhǎng)的平板, 如果:
b) 所有稀釋度的平板合計(jì)典型或可疑菌落數(shù)均小于15 CFU, 應(yīng)計(jì)數(shù)最低稀釋度平板上的典型或
可疑菌落數(shù);
d) 所有稀釋度的合計(jì)平板典型或可疑菌落數(shù)均不在15 CFU~150 CFU 之間, 其中一部分小于
15 CFU 或大于150 CFU 時(shí), 應(yīng)計(jì)數(shù)最接近15 CFU 或150 CFU 的稀釋度平板上的典型或可
疑菌落數(shù);
符合a) ~d) 者按9.1.1 中式(1) 計(jì)算。
8.4.2 從每個(gè)平板(符合5.2 要求的平板) 中挑取5 個(gè)典型或可疑菌落(少于5 個(gè)全選) , 按照5.3、5.4、
5.5 進(jìn)行鑒定。
9 結(jié)果與報(bào)告
9.1 計(jì)數(shù)方法
9.1 .1 式(1) :
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GB 4789.30—2025
T = AB
CVd … … … … … … … … … …( 1 )
式中:
T ———樣品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌落數(shù)[ CFU/g(mL) ];
A ———計(jì)數(shù)稀釋度典型或可疑菌落的總數(shù);
B ———計(jì)數(shù)稀釋度確證為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的菌落數(shù);
C ———計(jì)數(shù)稀釋度用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌確證試驗(yàn)的菌落數(shù);
V ———計(jì)數(shù)稀釋度的接種量, 以毫升(mL) 計(jì);
d ———稀釋因子。
9.1 .2 式(2) :
T =A1B1/C1 +A2B2/C2
Vd … … … … … … … … … …( 2 )
式中:
T ———樣品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌落數(shù)[ CFU/g(mL) ];
A1 ———第一計(jì)數(shù)稀釋度(低稀釋倍數(shù)) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌典型或可疑菌落的總數(shù);
A2 ———第二計(jì)數(shù)稀釋度(高稀釋倍數(shù)) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌典型或可疑菌落的總數(shù);
B1 ———第一計(jì)數(shù)稀釋度(低稀釋倍數(shù)) 鑒定結(jié)果為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的菌落數(shù);
B2 ———第二計(jì)數(shù)稀釋度(高稀釋倍數(shù)) 鑒定結(jié)果為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的菌落數(shù);
C1 ———第一計(jì)數(shù)稀釋度(低稀釋倍數(shù)) 用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌鑒定的菌落數(shù);
C2 ———第二計(jì)數(shù)稀釋度(高稀釋倍數(shù)) 用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌鑒定的菌落數(shù);
V ———第一計(jì)數(shù)稀釋度接種量加第二計(jì)數(shù)稀釋度1/10 接種量, 以毫升(mL) 計(jì), 如: 接種量采用
0.1 mL 方法的V 值為0.11; 接種量采用0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 方法的V 值為1.1;
d ———稀釋因子(第一個(gè)稀釋度) 。
9.2 結(jié)果報(bào)告
9.2.1 菌落數(shù)小于100 CFU 時(shí), 按“四舍五入”原則修約, 以整數(shù)報(bào)告。
9.2.2 菌落數(shù)大于或等于100 CFU 時(shí), 第3 位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后, 取前兩位數(shù)字, 后面用
0 代替位數(shù)。 也可用10 的指數(shù)形式來(lái)表示, 按“四舍五入”原則修約后, 保留兩位有效數(shù)字。
9.2.3 報(bào)告每g(mL) 樣品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌落數(shù), 以 CFU/g(mL) 表示; 如T 值為0, 接種
量采用0.1 mL 方法的以小于10 乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告。 接種量采用0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 方法的
以小于1 乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告。
第三法 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌 MPN 計(jì)數(shù)法
10 檢驗(yàn)程序
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌 MPN 計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖3。
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GB 4789.30—2025
圖3 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌 MPN 計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序
11 操作步驟
11 .1 樣品的稀釋
樣品稀釋液用磷酸鹽緩沖液。 樣品稀釋方法同8.1。
11 .2 接種和培養(yǎng)
11 .2.1 根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì), 選取3 個(gè)適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液) , 接
種于10 mL FB1 增菌肉湯, 每一稀釋度接種3 管, 每管接種1 mL。 如果接種量為10 mL, 接種至10 mL
雙料 FB1 增菌肉湯。 于30 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)24 h±2 h。 每管各吸取0.1 mL, 轉(zhuǎn)種于10 mL FB2 增菌肉湯
內(nèi), 于30 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)24 h±2 h。
11 .2.2 用接種環(huán)分別從 FB2 增菌肉湯各管中移取1 環(huán), 接種 OA 李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基(或其他等效
的李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基) 平板,36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)24 h~48 h。
11 .3 確證試驗(yàn)
從每個(gè)平板(符合5.2 要求的平板) 中挑取3 個(gè)~5 個(gè)典型或可疑菌落(少于3 個(gè)全選) , 按照5.3、
5.4、 5.5 進(jìn)行鑒定。
12 結(jié)果與報(bào)告
根據(jù)證實(shí)為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌陽(yáng)性的試管管數(shù), 查 MPN 檢索表( 見(jiàn)附錄 B) , 報(bào)告每克( 毫
升) 樣品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的最可能數(shù), 以 MPN/g(mL) 表示。
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GB 4789.30—2025
附 錄 A
培養(yǎng)基和試劑
A.1 含0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆肉湯(TSB-YE)
A.1 .1 成分
將上述各成分加熱攪拌溶解, 必要時(shí)調(diào)節(jié)pH, 分裝,121 ℃ 高壓滅菌15 min, 備用。 培養(yǎng)基滅菌后
25 ℃ 的pH 為7.2±0.2。
A.2 含0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE)
A.2.1 成分
將上述各成分加熱攪拌溶解, 必要時(shí)調(diào)節(jié) pH 至7.2 ±0.2, 分裝,121 ℃ 高壓滅菌15 min, 冷卻至
47 ℃ ~50 ℃ , 傾倒在無(wú)菌的平皿中, 備用。 培養(yǎng)基滅菌后25 ℃ 的pH 為7.2±0.2。
A.3 Fraser 增菌肉湯(FB1 、FB2 )
A.3.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基
A.3.1 .1 成分
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GB 4789.30—2025
將上述各成分加熱攪拌溶解, 必要時(shí)調(diào)節(jié)pH, 分裝,121 ℃ 高壓滅菌15 min, 冷卻至47 ℃ ~50 ℃ 。
培養(yǎng)基滅菌后25 ℃ 的pH 為7.2±0.2。
A.3.2 添加劑
A.3.2.1 1 %萘啶酮酸溶液
將0.5 g 萘啶酮酸鈉鹽溶于50 mL0.05 mol/L 氫氧化鈉中, 并通過(guò)0.45 μm 無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌。
A.3.2.2 0.25%鹽酸吖啶黃溶液
將0.25 g 鹽酸吖啶黃溶于100 mL 蒸餾水中, 用0.45 μm 的無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌。
A.3.2.3 5%檸檬酸鐵銨溶液
將5 g 檸檬酸鐵銨溶于100 mL 蒸餾水中, 用0.45 μm 的無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌。
A.3.3 完全培養(yǎng)基
A.3.3.1 FB1 增菌肉湯
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GB 4789.30—2025
A.4.1 .2 制法
將上述各成分加熱攪拌溶解, 必要時(shí)調(diào)節(jié)pH, 分裝,121 ℃ 高壓滅菌15 min, 冷卻至47 ℃ ~50 ℃ 。
培養(yǎng)基滅菌后25 ℃ 的pH 為7.2±0.2。
A.4.2 添加劑
A.4.2.1 0.4%萘啶酮酸溶液
將0.02 g 萘啶酮酸鈉鹽溶于5 mL 氫氧化鈉中, 并通過(guò)0.45 μm 無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌。
A.4.2.2 0.4%頭孢他啶溶液
將0.02 g 頭孢他啶溶于5 mL 蒸餾水中, 用0.45 μm 的無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌。
A.4.2.3 多黏菌素 B 溶液
將76 700IU 硫酸多黏菌素 B 溶于5 mL 蒸餾水中, 用0.45 μm 的無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌。
A.4.2.4 2%環(huán)己酰亞胺溶液
將0.05 g 環(huán)己酰亞胺溶于2.5 mL 無(wú)水乙醇中, 然后加蒸餾水 2.5 mL, 用0.45μm 的無(wú)菌濾膜過(guò)濾
除菌。
A.4.2.5 0.1 %兩性霉素 B 溶液(作為環(huán)己酰亞胺溶液的替代品)
將2.5 mL 鹽酸(1 mol/L) 和7.5 mL 二甲基甲酰胺(DMF) 混合成 HCl/DMF 溶液, 加0.01 g 兩性
霉素溶解后, 用0.45 μm 的無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌。
A.4.2.6 L-α-磷脂酰肌醇溶液
將2 g 的L-α-磷脂酰肌醇溶于50 mL 的蒸餾水中(可以使用2 g 含有9%~15%的未分級(jí)磷脂酰肌
醇的大豆卵磷脂代替 L-α-磷脂酰肌醇) , 攪拌約30 min 直至獲得均勻的懸浮液。 在121 ℃ 下高壓滅菌
15 min, 然后冷卻至47 ℃ ~50 ℃ 。
A.4.3 完全培養(yǎng)基
A.4.3.1 成分
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GB 4789.30—2025
在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(A.4.1) 冷卻至47 ℃ ~50 ℃ 時(shí), 依次加入萘啶酮酸、 頭孢他啶、 多黏菌素B、 環(huán)己酰亞
胺或兩性霉素 B、L-α-磷脂酰肌醇溶液。 每次添加均需要立即充分混合均勻。 完全培養(yǎng)基的 pH 在
25 ℃ 下應(yīng)為7.2±0.2, 介質(zhì)應(yīng)均勻呈輕微乳白色。 混勻后傾倒在無(wú)菌的平皿中, 每個(gè)培養(yǎng)皿中倒入
18 mL~20 mL, 凝固后備用。
A.5 PALCAM 培養(yǎng)基
A.5.1 成分
將上述各成分加熱攪拌溶解, 必要時(shí)調(diào)節(jié)pH, 分裝,121 ℃ 高壓滅菌15 min。 培養(yǎng)基滅菌后25 ℃
的pH 為7.2±0.2。
A.5.2.1 PALCAM 選擇性添加劑
將PALCAM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基冷卻至47 ℃ ~50 ℃ , 加入2 mL PALCAM 選擇性添加劑, 混勻后傾倒在
無(wú)菌的平皿中, 每個(gè)培養(yǎng)皿中倒入18 mL~20 mL, 凝固后備用。
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GB 4789.30—2025
A.6 革蘭氏染色液
A.6.1 結(jié)晶紫染色液
A.6.1 .1 成分
將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中, 然后與草酸銨水溶液混合。
A.6.2 革蘭氏碘液
A.6.2.1 成分
將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合, 加入少許蒸餾水, 充分振搖, 待完全溶解后, 再加蒸餾水至300 mL。
A.6.3 沙黃復(fù)染液
A.6.3.1 成分
A.6.4.1 涂片用火焰固定后滴加結(jié)晶紫染液, 作用1 min, 水洗。
A.6.4.2 滴加革蘭氏碘液, 作用1 min, 水洗。
A.6.4.3 滴加95%乙醇脫色15 s~30 s, 直至染色液被洗掉, 不要過(guò)分脫色, 水洗。
A.6.4.4 滴加復(fù)染液, 復(fù)染 1 min, 水洗、 待干、 鏡檢。
A.7 SIM 動(dòng)力培養(yǎng)基
A.7.1 成分
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GB 4789.30—2025
將上述各成分加熱攪拌溶解, 必要時(shí)調(diào)節(jié)pH, 分裝小試管,121 ℃ 高壓滅菌15 min, 備用。 培養(yǎng)基
滅菌后25 ℃ 的pH 為7.2±0.2。
A.8 緩沖葡萄糖蛋白胨水[甲基紅(MR) 和乙酰甲基醇(VP) 試驗(yàn)用]
A.8.1 成分
將上述各成分加熱攪拌溶解, 必要時(shí)調(diào)節(jié)pH, 分裝試管, 每管1 mL。 121 ℃ 高壓滅菌15 min, 備
用。 緩沖葡萄糖蛋白胨水滅菌后25 ℃ 的pH 為7.2±0.2。
A.8.3 甲基紅(MR) 試驗(yàn)
A.8.3.1 甲基紅試劑
A.8.3.1 .1 成分
10 mg 甲基紅溶于30 mL95%乙醇中, 然后加入20 mL 蒸餾水。
A.8.3.1 .3 試驗(yàn)方法
取適量瓊脂培養(yǎng)物接種于緩沖葡萄糖蛋白胨水中,36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)2 d~5 d。 滴加甲基紅試劑
1 滴, 立即觀察結(jié)果。 鮮紅色為陽(yáng)性, 黃色為陰性。
A.8.4 乙酰甲基甲醇(VP) 試驗(yàn)
A.8.4.1 6%α-萘酚-乙醇溶液
成分及制法: 取α-萘酚6.0 g, 加無(wú)水乙醇溶解, 定容至100 mL。
A.8.4.2 40%氫氧化鉀溶液
成分及制法: 取氫氧化鉀40 g, 加蒸餾水溶解, 定容至100 mL。
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GB 4789.30—2025
A.8.4.3 試驗(yàn)方法
取適量瓊脂培養(yǎng)物接種于緩沖葡萄糖蛋白胨水中,36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)2 d~4 d, 加入6% α-萘酚-乙醇
溶液0.5 mL 和40%氫氧化鉀溶液0.2 mL, 充分振搖試管, 觀察結(jié)果。 陽(yáng)性反應(yīng)立刻或于數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)
紅色, 如為陰性, 應(yīng)放在36 ℃ ±1 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)1 h 再進(jìn)行觀察。
A.9 羊血瓊脂
A.9.1 成分
除新鮮脫纖維羊血外, 加熱溶化上述各組分,121 ℃ 高壓滅菌15 min, 冷至50 ℃ , 以無(wú)菌操作加入
新鮮脫纖維羊血, 搖勻, 傾注平板。
A.10 無(wú)菌磷酸鹽緩沖液
A.10.1 儲(chǔ)存液成分
A.10.2.1 1 mol/L 氫氧化鈉: 稱取20.0 g 的氫氧化鈉溶于500 mL 蒸餾水中。
A.10.2.2 儲(chǔ)存液: 稱取34.0 g 的磷酸二氫鉀溶于500 mL 蒸餾水中, 用大約175 mL 的1 mol/L 氫氧
化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至7.2, 用蒸餾水定容至1 000 mL 后儲(chǔ)存于冰箱。
A.10.2.3 工作液: 取儲(chǔ)存液1.25 mL, 用蒸餾水稀釋至1 000 mL, 分裝于適宜容器中,121 ℃ 高壓滅菌
15 min。
A.11 無(wú)菌生理鹽水
A.11 .1 成分
稱取8.5g 的氯化鈉溶于1 000 mL 蒸餾水中, 分裝于適宜容器中,121 ℃ 高壓滅菌15 min。
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GB 4789.30—2025
A.12 糖發(fā)酵管
A.12.1 糖發(fā)酵基礎(chǔ)肉湯
A.12.2.1 將上述各成分加熱攪拌溶解, 必要時(shí)調(diào)節(jié)pH, 分裝每瓶100 mL,121 ℃ 高壓滅菌15 min, 備
用。 糖發(fā)酵基礎(chǔ)肉湯滅菌后25 ℃ 的pH 為7.4±0.2。
A.12.2.2 葡萄糖發(fā)酵管: 用蒸餾水將葡萄糖配制成10% 溶液,121 ℃ 高壓滅菌15 min。 無(wú)菌吸取5
mL 葡萄糖溶液加入按 A.12.2.1 配制的100 mL 糖發(fā)酵基礎(chǔ)肉湯內(nèi), 混勻后, 以無(wú)菌操作分裝于小試管
中, 備用。 葡萄糖發(fā)酵管25 ℃ 的pH 為7.4±0.2。
A.12.2.3 其他各種糖發(fā)酵管: 可按照 A.12.2.2 葡萄糖發(fā)酵管的配制方法制備其他糖類發(fā)酵管。
A.12.3 試驗(yàn)方法
取適量純培養(yǎng)物接種于糖發(fā)酵管,36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)24 h~48 h, 觀察結(jié)果, 藍(lán)色為陰性, 黃色為
陽(yáng)性。
A.13 過(guò)氧化氫試劑
A.13.1 試劑
3%過(guò)氧化氫溶液, 臨用配制。
A.13.2 過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)方法
用細(xì)玻璃棒或一次性接種針挑取單個(gè)菌落, 置于潔凈玻璃平皿內(nèi), 滴加3% 過(guò)氧化氫溶液2 滴, 觀
察結(jié)果。
A.13.3 結(jié)果
于0.5 min 內(nèi)發(fā)生氣泡者為陽(yáng)性, 不發(fā)生氣泡者為陰性。
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GB 4789.30—2025
附 錄 B
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌最可能數(shù)(MPN) 表
每克(毫升) 檢樣中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌最可能數(shù)(MPN) 的檢索見(jiàn)表 B.1。
表 B.1 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌最可能數(shù)(MPN) 檢索表
GB 4789.30—2025
食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗(yàn)
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)
2025-03-16 發(fā)布 2025-09-16 實(shí)施
中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)
國(guó) 家 市 場(chǎng) 監(jiān) 督 管 理 總 局 發(fā) 布
前 言
|
本標(biāo)準(zhǔn)代替 GB4789.30—2016《 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌檢驗(yàn)》。 |
單核細(xì)胞增生李斯特氏 |
———修改了適用范圍;
———修改了培養(yǎng)基和試劑, 增加了 OA 李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基配方;
———修改了第一法 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)增菌液、 選擇性培養(yǎng)基、 檢驗(yàn)程序、 鑒定方
法等;
———修改了第二法 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法的樣品接種、 菌落計(jì)數(shù)和確認(rèn)、 結(jié)果計(jì)
數(shù)、 結(jié)果報(bào)告;
———修改了第三法 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌 MPN 計(jì)數(shù)法的樣品接種。
1
GB 4789.30—2025
食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗(yàn)
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)
1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes ) 的檢驗(yàn)方法。
本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的定性檢驗(yàn); 第二法適用于單核細(xì)胞增生李
斯特氏菌含量較高的食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的計(jì)數(shù); 第三法適用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌
含量較低的食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的計(jì)數(shù)。
2 設(shè)備和材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外, 其他設(shè)備和材料如下。
2.1 冰箱:2 ℃ ~8 ℃ 。
2.2 恒溫培養(yǎng)箱:30 ℃ ±1 ℃ 、36 ℃ ±1 ℃ 、25 ℃ ~30 ℃ 。
2.3 均質(zhì)器。
2.4 顯微鏡:100 × ~1 000 × 。
2.5 電子天平: 感量為0.1 g、0.1 mg。
2.6 錐形瓶:100 mL、500 mL。
2.7 無(wú)菌吸管:1 mL( 具0.01 mL 刻度) 、10 mL( 具0.1 mL 刻度) 或移液器( 量程為0.1 mL、1 mL、
10 mL) 及無(wú)菌吸頭。
2.8 無(wú)菌培養(yǎng)皿: 直徑90 mm。
2.9 無(wú)菌試管:16 mm × 160 mm。
2.10 離心機(jī):4 000 r/min。
2.11 無(wú)菌離心管:30 mm × 100 mm。
2.12 無(wú)菌注射器:1 mL。
2.13 油鏡或相差顯微鏡。
2.14 無(wú)菌涂布棒。
2.15 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes )ATCC 19111 或 CMCC 54004 或其他等效
菌株。
2.16 英諾克李斯特氏菌(Listeriainnocua )ATCC33090 或其他等效菌株。
2.17 伊氏李斯特氏菌(Listeriaivanovii )ATCC19119 或其他等效菌株。
2.18 斯氏李斯特氏菌(Listeriaseeligeri )ATCC35967 或其他等效菌株。
2.19 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )ATCC25923 或其他等效菌株, 要求產(chǎn)β-溶血環(huán)。
2.20 馬紅球菌(Rhodococcus equi )ATCC6939 或 NCTC1621 或其他等效菌株。
2.21 小鼠:ICR 品系, 體重18 g~22 g。
1
GB 4789.30—2025
2.22 微生物生化鑒定系統(tǒng)。
2.23 無(wú)菌過(guò)濾裝置。
3 培養(yǎng)基和試劑
3.1 含0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆肉湯(TSB-YE) : 見(jiàn)附錄 A 中 A.1。
3.2 含0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE) : 見(jiàn) A.2。
3.3 Fraser 增菌肉湯(FB1 、FB2 ) : 見(jiàn) A.3。
3.4 OA 李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基: 見(jiàn) A.4。
3.5 PALCAM 培養(yǎng)基: 見(jiàn) A.5。
3.6 革蘭氏染色液: 見(jiàn) A.6。
3.7 SIM 動(dòng)力培養(yǎng)基: 見(jiàn) A.7。
3.8 緩沖葡萄糖蛋白胨水[甲基紅(MR) 和乙酰甲基醇(VP) 試驗(yàn)用]: 見(jiàn) A.8。
3.9 羊血瓊脂: 見(jiàn) A.9。
3.10 無(wú)菌磷酸鹽緩沖液: 見(jiàn) A.10。
3.11 無(wú)菌生理鹽水: 見(jiàn) A.11。
3.12 糖發(fā)酵管: 見(jiàn) A.12。
3.13 過(guò)氧化氫試劑: 見(jiàn) A.13。
3.14 微生物生化鑒定試劑盒。
第一法 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)
4 檢驗(yàn)程序
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖1。
2
GB 4789.30—2025
圖1 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)程序
5 操作步驟
5.1 增菌
以無(wú)菌操作取25 g (mL) 樣品, 置于盛有225 mL FB1 增菌肉湯的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi),8 000 r/min~
10 000 r/min 均質(zhì)1 min~2 min, 或放入盛有225 mL FB1 增菌肉湯的無(wú)菌均質(zhì)袋中, 用拍擊式均質(zhì)器
拍打1 min~2 min, 制成1∶ 10 的樣品勻液。 若樣品為液態(tài), 也可采用振蕩或攪拌混勻。 于30 ℃ ±1 ℃
培養(yǎng)24 h±2 h。 混勻, 吸取0.1 mL FB1 增菌肉湯, 轉(zhuǎn)種于10 mL FB2 增菌肉湯內(nèi)。 于30 ℃ ±1 ℃ 培
養(yǎng)24 h±2 h。
5.2 分離
取混勻后的 FB2 增菌肉湯, 分別接種于 OA 李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基(或其他等效李斯特氏菌顯色
培養(yǎng)基) 平板和 PALCAM 培養(yǎng)基平板,36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)24 h~48 h, 觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落。 典
型菌落在 OA 李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基平板上形成直徑為1 mm~3 mm 的圓形藍(lán)綠色菌落, 周?chē)胁煌?br /> 3
GB 4789.30—2025
明的暈圈。 典型菌落在 PALCAM 培養(yǎng)基平板上形成直徑為1 mm~3 mm 的圓形灰綠色菌落, 周?chē)?br /> 棕黑色水解圈, 培養(yǎng)48 h 后, 部分菌落中心形成黑點(diǎn)且有凹陷。 其他等效李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基平板
上的菌落特征參照產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行判定。
注1 : 一些單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在 OA 李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上的菌落周?chē)臅炄Σ幻黠@甚至沒(méi)有暈圈。 還
有一些單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在 OA 李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上的菌落周?chē)臅炄Τ霈F(xiàn)得比較遲緩, 有時(shí)
需要4d 以上才出現(xiàn)。
注2: 伊氏李斯特氏菌在 OA 李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)與單核細(xì)胞增生李斯特氏菌相似。
5.3 純培養(yǎng)
從每個(gè)平板(符合5.2 要求的平板) 中挑取3 個(gè)~5 個(gè)典型或可疑菌落(少于3 個(gè)全選) , 在 TSA-YE
平板或羊血平板上劃線, 于36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)18 h~24 h。 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在 TSA-YE 平板或
羊血平板上, 呈灰白色, 半透明, 邊緣整齊, 露滴狀菌落、 直徑為1 mm~2 mm。
5.4 初步鑒定
挑取 TSA-YE 平板或羊血平板上的單個(gè)菌落, 接種木糖、 鼠李糖發(fā)酵管, 于36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)24 h±
2 h; 同時(shí)在 TSA-YE 平板或羊血平板上劃線, 于36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)18 h~24 h, 以獲取下一步鑒定用的
純培養(yǎng)物。 然后選擇木糖陰性, 鼠李糖陽(yáng)性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行鑒定。
5.5 鑒定
注: 可先從每個(gè)平板(符合5.2 要求的平板) 中挑取1 株菌進(jìn)行鑒定試驗(yàn), 如果鑒定為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌, 可
直接按6 結(jié)果與報(bào)告的規(guī)定報(bào)告檢出結(jié)果; 按5.3 要求挑取的3 個(gè)~5 個(gè)典型或可疑菌落(少于3 個(gè)全選) 均鑒
定為非單核細(xì)胞增生李斯特氏菌后方可報(bào)告未檢出的結(jié)果。
5.5.1 鏡檢: 挑取18 h~24 h 純培養(yǎng)的單個(gè)菌落做革蘭氏染色鏡檢, 李斯特氏菌為革蘭氏陽(yáng)性短桿菌,
大小為(0.4 μm~0.5 μm) × (0.5 μm~2.0 μm) 。 用生理鹽水制成菌懸液, 在油鏡或相差顯微鏡下觀察,
該菌出現(xiàn)輕微旋轉(zhuǎn)或翻滾樣的運(yùn)動(dòng)。
5.5.2 動(dòng)力試驗(yàn): 挑取18 h~24 h 純培養(yǎng)的單菌落穿刺半固體或SIM 動(dòng)力培養(yǎng)基, 于25 ℃ ~30 ℃ 培
養(yǎng)48 h±2 h。 李斯特氏菌沿穿刺線以不規(guī)則的云霧狀向四周延伸生長(zhǎng), 培養(yǎng)基表面下3 mm~5 mm
處形成一似傘狀(或梭狀) 界面。 如傘狀( 或梭狀) 生長(zhǎng)不明顯, 可繼續(xù)培養(yǎng), 每天觀察結(jié)果1 次, 觀察
5 d。
5.5.3 生化鑒定: 挑取18 h~24 h 純培養(yǎng)的單個(gè)菌落, 進(jìn)行過(guò)氧化氫酶試驗(yàn), 過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性反應(yīng)的菌
落繼續(xù)進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)、MR-VP 試驗(yàn)。 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的主要生化特征見(jiàn)表1。
5.5.4 溶血試驗(yàn): 將新鮮的羊血瓊脂平板底面劃分為20 個(gè)~25 個(gè)小格, 挑取18 h~24 h 純培養(yǎng)的單個(gè)
菌落刺種到血平板上, 每格刺種1 個(gè)菌落, 并刺種陽(yáng)性對(duì)照菌(單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、 伊氏李斯特氏
菌和斯氏李斯特氏菌) 和陰性對(duì)照菌(英諾克李斯特氏菌) , 穿刺時(shí)盡量接近底部, 但不要觸到底面, 同時(shí)
避免瓊脂破裂,36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)24 h~48 h, 于明亮處觀察, 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌呈現(xiàn)狹窄、 清晰、
明亮的溶血圈, 斯氏李斯特氏菌在刺種點(diǎn)周?chē)a(chǎn)生狹窄、 微弱的溶血環(huán), 英諾克李斯特氏菌無(wú)溶血環(huán), 伊
氏李斯特氏菌產(chǎn)生寬的、 輪廓清晰的β-溶血區(qū)域。
5.5.5 協(xié)同溶血試驗(yàn) CAMP(可選項(xiàng)目) : 在羊血瓊脂平板上平行劃線接種金黃色葡萄球菌和馬紅球
菌, 挑取18 h~24 h 純培養(yǎng)的單個(gè)菌落垂直劃線接種于平行線之間, 垂直線兩端不要觸及平行線, 距離
1 mm~2 mm, 同時(shí)接種單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、 英諾克李斯特氏菌、 伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特
氏菌, 于36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)24 h~48 h。 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在靠近金黃色葡萄球菌處出現(xiàn)約
2 mm 的β-溶血增強(qiáng)區(qū)域, 斯氏李斯特氏菌也出現(xiàn)微弱的溶血增強(qiáng)區(qū)域, 伊氏李斯特氏菌在靠近馬紅球
菌處出現(xiàn)5 mm~10 mm 的“箭頭狀”β-溶血增強(qiáng)區(qū)域, 英諾克李斯特氏菌不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。 若結(jié)果不
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明顯, 可置2 ℃ ~8℃ 冰箱24 h~48 h 再觀察。
注: 有5% ~8% 的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌可在馬紅球菌一端形成輕微溶血增強(qiáng)(約1 mm) 現(xiàn)象, 此現(xiàn)象不屬于
溶血增強(qiáng)的情況。
表1 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌主要鑒定特征及與其他李斯特氏菌的區(qū)別
| 菌種 | 木糖 | 鼠李糖 | 葡萄糖 | 麥芽糖 | 甘露醇 | 七葉苷 | MR-VP | 溶血試驗(yàn) |
|
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌 (L .monocytogenes ) |
- | + | + | + | - | + | +/+ | + |
|
格氏李斯特氏菌 (L .grayi ) |
- | - | + | + | + | + | +/+ | - |
|
斯氏李斯特氏菌 (L s. eeligeri ) |
+ | - | + | + | - | + | +/+ | + |
|
威氏李斯特氏菌 (L .welshimeri ) |
+ | V | + | + | - | + | +/+ | - |
|
伊氏李斯特氏菌 (L i. vanovii ) |
+ | - | + | + | - | + | +/+ | + |
|
英諾克李斯特氏菌 (L i. nnocua ) |
- | V | + | + | - | + | +/+ | - |
| 部分單核細(xì)胞增生李斯特氏菌不溶血。 個(gè)別單核細(xì)胞增生李斯特氏菌血清型不能發(fā)酵鼠李糖 | ||||||||
|
注: - 表示90% ~100% 的菌株陰性; + 表示90% ~100% 的菌株陽(yáng)性; V 表示反應(yīng)不定。 |
平板上挑取可疑菌落, 用生理鹽水制備成濁度適當(dāng)?shù)木鷳乙?/span>, 使用微生物生化鑒定試劑盒或微生物生化
鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。
5.6 小鼠毒力試驗(yàn)(可選項(xiàng)目)
將符合上述特性的純培養(yǎng)物接種于 TSB-YE 中, 于36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)24 h,4000r/min 離心5 min,
棄上清液, 用無(wú)菌生理鹽水制備成濃度為1010 CFU/mL 的菌懸液, 取此菌懸液對(duì)3 只~5 只小鼠進(jìn)行
腹腔注射, 每只0.5 mL, 同時(shí)觀察小鼠死亡情況。 小鼠于2 d~5 d 內(nèi)死亡者為致病株。 試驗(yàn)設(shè)單核細(xì)
胞增生李斯特氏菌致病株和無(wú)菌生理鹽水對(duì)照組。 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、 伊氏李斯特氏菌對(duì)小鼠
有致病性。
6 結(jié)果與報(bào)告
綜合5.4、5.5 鑒定結(jié)果, 報(bào)告25 g(mL) 樣品中檢出或未檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。 25 g(mL)
樣品中未檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌也可報(bào)告為0/25 g(mL) 。
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第二法 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法
7 檢驗(yàn)程序
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)程序見(jiàn)圖2。
圖2 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)程序
8 操作步驟
8.1 樣品的稀釋
8.1 .1 以無(wú)菌操作取25 g(mL) 樣品, 置于盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或無(wú)添加劑的Fraser 增菌肉湯的
無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi),8 000r/min~10 000r/min 均質(zhì)1 min~2 min, 或放入盛有225 mL 上述稀釋液的無(wú)菌
均質(zhì)袋中, 用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min~2 min, 制成1∶ 10 的樣品勻液。 若樣品為液態(tài), 也可采用振蕩
或攪拌混勻, 制成1∶ 10 的樣品勻液。
8.1 .2 用1 mL 無(wú)菌吸管或移液器吸取1∶ 10 樣品勻液1 mL, 沿管壁緩慢注于盛有9 mL 磷酸鹽緩沖
液或無(wú)添加劑的 Fraser 增菌肉湯的無(wú)菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面) , 充分混勻,
制成1∶ 100 的樣品勻液。
8.1 .3 按8.1.2 操作程序, 制備10 倍系列稀釋樣品勻液。 每遞增稀釋1 次, 換用1 支1 mL 無(wú)菌吸管或
吸頭。
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8.2 樣品的接種
8.2.1 根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì), 選擇2 個(gè)~3 個(gè)適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液( 液體樣品可包括原
液) , 每個(gè)稀釋度分別吸取0.1mL 樣品勻液, 接種1 個(gè) OA 李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基( 或其他等效的李斯
特氏菌顯色培養(yǎng)基) 平板。 并用無(wú)菌涂布棒涂布整個(gè)平板, 注意不要觸及平板邊緣。 使用前, 如瓊脂平
板表面有水珠, 可放在25 ℃ ~50 ℃ 的培養(yǎng)箱里干燥, 直到平板表面的水珠消失。
注: 必要時(shí), 每個(gè)稀釋度可做重復(fù)試驗(yàn)。
8.2.2 對(duì) 于 單 核 細(xì) 胞 增 生 李 斯 特 氏 菌 含 量 較 低 的 食 品 樣 品, 吸 取 1mL 最 低 稀 釋 度 樣 品 勻 液, 以
0.3 mL、 0.3 mL、0.4 mL 的接種量分別涂布于3 塊 OA 李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基(或其他等效的李斯特
氏菌顯色培養(yǎng)基) 平板。 涂布方法同8.2.1。
8.2.3 從樣品稀釋至樣品接種完畢不得超過(guò)45 min。
8.3 培養(yǎng)
8.3.1 通常情況下, 涂布后, 將平板正置于水平桌上10 min~20 min 后翻轉(zhuǎn)平皿, 放入培養(yǎng)箱培養(yǎng),
36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)24 h~48 h。
8.3.2 如果樣液不易吸收, 可將平板正置在培養(yǎng)箱36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)1 h, 等樣品勻液吸收后再翻轉(zhuǎn)平
皿, 倒置于培養(yǎng)箱,36 ℃ ±1 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)24 h~48 h。
8.4 典型菌落計(jì)數(shù)和確認(rèn)
8.4.1 選擇有典型或可疑單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌落生長(zhǎng)的平板, 如果:
| a) |
只有1 個(gè)稀釋度的平板合計(jì)典型或可疑菌落數(shù)在15 CFU~150 CFU 之間, 應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋度 平板上的典型或可疑菌落數(shù); |
可疑菌落數(shù);
| c) |
所有稀釋度的平板合計(jì)典型或可疑菌落數(shù)大于 150 CFU, 應(yīng)計(jì)數(shù)最高稀釋度平板上的典型或 可疑菌落數(shù); |
15 CFU 或大于150 CFU 時(shí), 應(yīng)計(jì)數(shù)最接近15 CFU 或150 CFU 的稀釋度平板上的典型或可
疑菌落數(shù);
符合a) ~d) 者按9.1.1 中式(1) 計(jì)算。
| e) |
2 個(gè)連續(xù)稀釋度的合計(jì)平板典型或可疑菌落數(shù)均在15 CFU~150 CFU 之間, 按9.1.2 中式(2) 計(jì)算。 |
5.5 進(jìn)行鑒定。
9 結(jié)果與報(bào)告
9.1 計(jì)數(shù)方法
9.1 .1 式(1) :
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T = AB
CVd … … … … … … … … … …( 1 )
式中:
T ———樣品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌落數(shù)[ CFU/g(mL) ];
A ———計(jì)數(shù)稀釋度典型或可疑菌落的總數(shù);
B ———計(jì)數(shù)稀釋度確證為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的菌落數(shù);
C ———計(jì)數(shù)稀釋度用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌確證試驗(yàn)的菌落數(shù);
V ———計(jì)數(shù)稀釋度的接種量, 以毫升(mL) 計(jì);
d ———稀釋因子。
9.1 .2 式(2) :
T =A1B1/C1 +A2B2/C2
Vd … … … … … … … … … …( 2 )
式中:
T ———樣品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌落數(shù)[ CFU/g(mL) ];
A1 ———第一計(jì)數(shù)稀釋度(低稀釋倍數(shù)) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌典型或可疑菌落的總數(shù);
A2 ———第二計(jì)數(shù)稀釋度(高稀釋倍數(shù)) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌典型或可疑菌落的總數(shù);
B1 ———第一計(jì)數(shù)稀釋度(低稀釋倍數(shù)) 鑒定結(jié)果為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的菌落數(shù);
B2 ———第二計(jì)數(shù)稀釋度(高稀釋倍數(shù)) 鑒定結(jié)果為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的菌落數(shù);
C1 ———第一計(jì)數(shù)稀釋度(低稀釋倍數(shù)) 用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌鑒定的菌落數(shù);
C2 ———第二計(jì)數(shù)稀釋度(高稀釋倍數(shù)) 用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌鑒定的菌落數(shù);
V ———第一計(jì)數(shù)稀釋度接種量加第二計(jì)數(shù)稀釋度1/10 接種量, 以毫升(mL) 計(jì), 如: 接種量采用
0.1 mL 方法的V 值為0.11; 接種量采用0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 方法的V 值為1.1;
d ———稀釋因子(第一個(gè)稀釋度) 。
9.2 結(jié)果報(bào)告
9.2.1 菌落數(shù)小于100 CFU 時(shí), 按“四舍五入”原則修約, 以整數(shù)報(bào)告。
9.2.2 菌落數(shù)大于或等于100 CFU 時(shí), 第3 位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后, 取前兩位數(shù)字, 后面用
0 代替位數(shù)。 也可用10 的指數(shù)形式來(lái)表示, 按“四舍五入”原則修約后, 保留兩位有效數(shù)字。
9.2.3 報(bào)告每g(mL) 樣品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌落數(shù), 以 CFU/g(mL) 表示; 如T 值為0, 接種
量采用0.1 mL 方法的以小于10 乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告。 接種量采用0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 方法的
以小于1 乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告。
第三法 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌 MPN 計(jì)數(shù)法
10 檢驗(yàn)程序
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌 MPN 計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖3。
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圖3 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌 MPN 計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序
11 操作步驟
11 .1 樣品的稀釋
樣品稀釋液用磷酸鹽緩沖液。 樣品稀釋方法同8.1。
11 .2 接種和培養(yǎng)
11 .2.1 根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì), 選取3 個(gè)適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液) , 接
種于10 mL FB1 增菌肉湯, 每一稀釋度接種3 管, 每管接種1 mL。 如果接種量為10 mL, 接種至10 mL
雙料 FB1 增菌肉湯。 于30 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)24 h±2 h。 每管各吸取0.1 mL, 轉(zhuǎn)種于10 mL FB2 增菌肉湯
內(nèi), 于30 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)24 h±2 h。
11 .2.2 用接種環(huán)分別從 FB2 增菌肉湯各管中移取1 環(huán), 接種 OA 李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基(或其他等效
的李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基) 平板,36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)24 h~48 h。
11 .3 確證試驗(yàn)
從每個(gè)平板(符合5.2 要求的平板) 中挑取3 個(gè)~5 個(gè)典型或可疑菌落(少于3 個(gè)全選) , 按照5.3、
5.4、 5.5 進(jìn)行鑒定。
12 結(jié)果與報(bào)告
根據(jù)證實(shí)為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌陽(yáng)性的試管管數(shù), 查 MPN 檢索表( 見(jiàn)附錄 B) , 報(bào)告每克( 毫
升) 樣品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的最可能數(shù), 以 MPN/g(mL) 表示。
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附 錄 A
培養(yǎng)基和試劑
A.1 含0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆肉湯(TSB-YE)
A.1 .1 成分
|
胰蛋白胨(胰酪胨) 多價(jià)胨 酵母膏粉 氯化鈉 磷酸氫二鉀 葡萄糖 蒸餾水 A.1 .2 制法 |
17.0 g 3.0 g 6.0 g 5.0 g 2.5 g 2.5 g 1 000 mL |
25 ℃ 的pH 為7.2±0.2。
A.2 含0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE)
A.2.1 成分
|
胰蛋白胨(胰酪胨) 多價(jià)胨 酵母膏粉 氯化鈉 磷酸氫二鉀 葡萄糖 瓊脂 蒸餾水 A.2.2 制法 |
17.0 g 3.0 g 6.0 g 5.0 g 2.5 g 2.5 g 15.0 g 1 000 mL |
47 ℃ ~50 ℃ , 傾倒在無(wú)菌的平皿中, 備用。 培養(yǎng)基滅菌后25 ℃ 的pH 為7.2±0.2。
A.3 Fraser 增菌肉湯(FB1 、FB2 )
A.3.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基
A.3.1 .1 成分
|
胰蛋白胨(胰酪胨) 牛肉膏粉 酵母膏粉 蛋白胨 |
5.0 g 5.0 g 5.0 g 5.0 g |
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|
氯化鈉 磷酸二氫鉀 磷酸氫二鈉 氯化鋰 七葉苷 蒸餾水 A.3.1 .2 制法 |
20.0 g 1.35 g 12.0 g 3.0 g 1.0 g 1 000 mL |
培養(yǎng)基滅菌后25 ℃ 的pH 為7.2±0.2。
A.3.2 添加劑
A.3.2.1 1 %萘啶酮酸溶液
將0.5 g 萘啶酮酸鈉鹽溶于50 mL0.05 mol/L 氫氧化鈉中, 并通過(guò)0.45 μm 無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌。
A.3.2.2 0.25%鹽酸吖啶黃溶液
將0.25 g 鹽酸吖啶黃溶于100 mL 蒸餾水中, 用0.45 μm 的無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌。
A.3.2.3 5%檸檬酸鐵銨溶液
將5 g 檸檬酸鐵銨溶于100 mL 蒸餾水中, 用0.45 μm 的無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌。
A.3.3 完全培養(yǎng)基
A.3.3.1 FB1 增菌肉湯
|
基礎(chǔ)培養(yǎng)基(A.3.1) 1%萘啶酮酸溶液(A.3.2.1) 0.25%鹽酸吖啶黃溶液(A.3.2.2) 5%檸檬酸鐵銨溶液(A.3.2.3) A.3.3.2 FB2 增菌肉湯 基礎(chǔ)培養(yǎng)基(A.3.1) 1%萘啶酮酸溶液(A.3.2.1) 0.25%鹽酸吖啶黃溶液(A.3.2.2) 5%檸檬酸鐵銨溶液(A.3.2.3) |
984 mL 1 mL 5 mL 10 mL |
|
978 mL 2 mL 10 mL 10 mL |
|
| A.4 OA 李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基(Agar Listeriaaccordingto Ottaviani and Agosti) | |
|
A.4.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 A.4.1 .1 成分 蛋白胨 胰蛋白胨(胰酪胨) 酵母膏粉 丙酮酸鈉 葡萄糖 |
18.0 g 6.0 g 10.0 g 2.0 g 2.0 g |
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|
甘油磷酸鎂 硫酸鎂(無(wú)水) 氯化鈉 氯化鋰 磷酸氫二鈉(無(wú)水) |
1.0 g 0.5 g 5.0 g 10.0 g 2.5 g |
| 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃葡萄糖苷(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucopyranoside) | |
|
0.05 g 15.0 g 930 mL* |
瓊脂 蒸餾水 注: * 表示如果用兩性霉素 B 替代環(huán)己酰亞胺, 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制體積改為925 mL。 |
將上述各成分加熱攪拌溶解, 必要時(shí)調(diào)節(jié)pH, 分裝,121 ℃ 高壓滅菌15 min, 冷卻至47 ℃ ~50 ℃ 。
培養(yǎng)基滅菌后25 ℃ 的pH 為7.2±0.2。
A.4.2 添加劑
A.4.2.1 0.4%萘啶酮酸溶液
將0.02 g 萘啶酮酸鈉鹽溶于5 mL 氫氧化鈉中, 并通過(guò)0.45 μm 無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌。
A.4.2.2 0.4%頭孢他啶溶液
將0.02 g 頭孢他啶溶于5 mL 蒸餾水中, 用0.45 μm 的無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌。
A.4.2.3 多黏菌素 B 溶液
將76 700IU 硫酸多黏菌素 B 溶于5 mL 蒸餾水中, 用0.45 μm 的無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌。
A.4.2.4 2%環(huán)己酰亞胺溶液
將0.05 g 環(huán)己酰亞胺溶于2.5 mL 無(wú)水乙醇中, 然后加蒸餾水 2.5 mL, 用0.45μm 的無(wú)菌濾膜過(guò)濾
除菌。
A.4.2.5 0.1 %兩性霉素 B 溶液(作為環(huán)己酰亞胺溶液的替代品)
將2.5 mL 鹽酸(1 mol/L) 和7.5 mL 二甲基甲酰胺(DMF) 混合成 HCl/DMF 溶液, 加0.01 g 兩性
霉素溶解后, 用0.45 μm 的無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌。
A.4.2.6 L-α-磷脂酰肌醇溶液
將2 g 的L-α-磷脂酰肌醇溶于50 mL 的蒸餾水中(可以使用2 g 含有9%~15%的未分級(jí)磷脂酰肌
醇的大豆卵磷脂代替 L-α-磷脂酰肌醇) , 攪拌約30 min 直至獲得均勻的懸浮液。 在121 ℃ 下高壓滅菌
15 min, 然后冷卻至47 ℃ ~50 ℃ 。
A.4.3 完全培養(yǎng)基
A.4.3.1 成分
|
基礎(chǔ)培養(yǎng)基(A.4.1) 0.4%萘啶酮酸溶液(A.4.2.1) 0.4%頭孢他啶溶液(A.4.2.2) |
930 mL 5 mL 5 mL |
GB 4789.30—2025
|
多黏菌素 B 溶液(A.4.2.3) 2%環(huán)己酰亞胺溶液(A.4.2.4) 或0.1%兩性霉素 B 溶液(A.4.2.5) L-α-磷脂酰肌醇溶液(A.4.2.6) |
5 mL 5 mL 10 mL 50 mL |
胺或兩性霉素 B、L-α-磷脂酰肌醇溶液。 每次添加均需要立即充分混合均勻。 完全培養(yǎng)基的 pH 在
25 ℃ 下應(yīng)為7.2±0.2, 介質(zhì)應(yīng)均勻呈輕微乳白色。 混勻后傾倒在無(wú)菌的平皿中, 每個(gè)培養(yǎng)皿中倒入
18 mL~20 mL, 凝固后備用。
A.5 PALCAM 培養(yǎng)基
A.5.1 成分
|
酵母膏粉 葡萄糖 七葉苷 檸檬酸鐵銨 甘露醇 酚紅 氯化鋰 酪蛋白胰酶消化物(酪蛋白胨) 心胰酶消化物 玉米淀粉 肉胃酶消化物 氯化鈉 瓊脂 蒸餾水 A.5.2 制法 |
8.0 g 0.5 g 0.8 g 0.5 g 10.0 g 0.1 g 15.0 g 10.0 g 3.0 g 1.0 g 5.0 g 5.0 g 15.0 g 1 000 mL |
的pH 為7.2±0.2。
A.5.2.1 PALCAM 選擇性添加劑
|
多黏菌素 B 鹽酸吖啶黃 頭孢他啶 無(wú)菌蒸餾水 A.5.2.2 制法 |
10.0 mg 5.0 mg 20.0 mg 2 mL |
無(wú)菌的平皿中, 每個(gè)培養(yǎng)皿中倒入18 mL~20 mL, 凝固后備用。
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GB 4789.30—2025
A.6 革蘭氏染色液
A.6.1 結(jié)晶紫染色液
A.6.1 .1 成分
|
結(jié)晶紫 95% 乙醇 1% 草酸銨水溶液 A.6.1 .2 制法 |
1.0 g 20.0 mL 80.0 mL |
A.6.2 革蘭氏碘液
A.6.2.1 成分
|
碘 碘化鉀 蒸餾水 A.6.2.2 制法 |
1.0 g 2.0 g 300 mL |
A.6.3 沙黃復(fù)染液
A.6.3.1 成分
|
沙黃 95%乙醇 蒸餾水 A.6.3.2 制法 將沙黃溶解于乙醇中, 然后用蒸餾水稀釋。 A.6.4 染色法 |
0.25 g 10.0 mL 90.0 mL |
A.6.4.2 滴加革蘭氏碘液, 作用1 min, 水洗。
A.6.4.3 滴加95%乙醇脫色15 s~30 s, 直至染色液被洗掉, 不要過(guò)分脫色, 水洗。
A.6.4.4 滴加復(fù)染液, 復(fù)染 1 min, 水洗、 待干、 鏡檢。
A.7 SIM 動(dòng)力培養(yǎng)基
A.7.1 成分
|
胰蛋白胨(胰酪胨) 多價(jià)胨 硫酸鐵銨 |
20.0 g 6.0 g 0.2 g |
GB 4789.30—2025
|
硫代硫酸鈉 瓊脂 蒸餾水 A.7.2 制法 |
0.2 g 3.5 g 1 000 mL |
滅菌后25 ℃ 的pH 為7.2±0.2。
A.8 緩沖葡萄糖蛋白胨水[甲基紅(MR) 和乙酰甲基醇(VP) 試驗(yàn)用]
A.8.1 成分
|
多價(jià)胨 葡萄糖 磷酸氫二鉀 蒸餾水 A.8.2 制法 |
7.0 g 5.0 g 5.0 g 1 000 mL |
用。 緩沖葡萄糖蛋白胨水滅菌后25 ℃ 的pH 為7.2±0.2。
A.8.3 甲基紅(MR) 試驗(yàn)
A.8.3.1 甲基紅試劑
A.8.3.1 .1 成分
|
甲基紅 95% 乙醇 蒸餾水 A.8.3.1 .2 制法 |
10 mg 30 mL 20 mL |
A.8.3.1 .3 試驗(yàn)方法
取適量瓊脂培養(yǎng)物接種于緩沖葡萄糖蛋白胨水中,36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)2 d~5 d。 滴加甲基紅試劑
1 滴, 立即觀察結(jié)果。 鮮紅色為陽(yáng)性, 黃色為陰性。
A.8.4 乙酰甲基甲醇(VP) 試驗(yàn)
A.8.4.1 6%α-萘酚-乙醇溶液
成分及制法: 取α-萘酚6.0 g, 加無(wú)水乙醇溶解, 定容至100 mL。
A.8.4.2 40%氫氧化鉀溶液
成分及制法: 取氫氧化鉀40 g, 加蒸餾水溶解, 定容至100 mL。
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GB 4789.30—2025
A.8.4.3 試驗(yàn)方法
取適量瓊脂培養(yǎng)物接種于緩沖葡萄糖蛋白胨水中,36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)2 d~4 d, 加入6% α-萘酚-乙醇
溶液0.5 mL 和40%氫氧化鉀溶液0.2 mL, 充分振搖試管, 觀察結(jié)果。 陽(yáng)性反應(yīng)立刻或于數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)
紅色, 如為陰性, 應(yīng)放在36 ℃ ±1 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)1 h 再進(jìn)行觀察。
A.9 羊血瓊脂
A.9.1 成分
|
蛋白胨 牛肉膏 氯化鈉 瓊脂 蒸餾水 脫纖維羊血 A.9.2 制法 |
1.0 g 0.3 g 0.5 g 1.5 g 100 mL 5 mL~8 mL |
新鮮脫纖維羊血, 搖勻, 傾注平板。
A.10 無(wú)菌磷酸鹽緩沖液
A.10.1 儲(chǔ)存液成分
|
磷酸二氫鉀(KH2PO4 ) 1 mol/L 氫氧化鈉 蒸餾水 A.10.2 制法 |
34.0 g 約175 mL 1 000 mL |
A.10.2.2 儲(chǔ)存液: 稱取34.0 g 的磷酸二氫鉀溶于500 mL 蒸餾水中, 用大約175 mL 的1 mol/L 氫氧
化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至7.2, 用蒸餾水定容至1 000 mL 后儲(chǔ)存于冰箱。
A.10.2.3 工作液: 取儲(chǔ)存液1.25 mL, 用蒸餾水稀釋至1 000 mL, 分裝于適宜容器中,121 ℃ 高壓滅菌
15 min。
A.11 無(wú)菌生理鹽水
A.11 .1 成分
|
氯化鈉 蒸餾水 A.11 .2 制法 |
8.5 g 1 000 mL |
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A.12 糖發(fā)酵管
A.12.1 糖發(fā)酵基礎(chǔ)肉湯
|
牛肉膏 蛋白胨 氯化鈉 十二水磷酸氫二鈉(Na2 HPO4 · 12H2O) 0.2%溴麝香草酚藍(lán)溶液 蒸餾水 A.12.2 制法 |
5.0 g 10.0 g 3.0 g 2.0 g 12.0 mL 1 000 mL |
用。 糖發(fā)酵基礎(chǔ)肉湯滅菌后25 ℃ 的pH 為7.4±0.2。
A.12.2.2 葡萄糖發(fā)酵管: 用蒸餾水將葡萄糖配制成10% 溶液,121 ℃ 高壓滅菌15 min。 無(wú)菌吸取5
mL 葡萄糖溶液加入按 A.12.2.1 配制的100 mL 糖發(fā)酵基礎(chǔ)肉湯內(nèi), 混勻后, 以無(wú)菌操作分裝于小試管
中, 備用。 葡萄糖發(fā)酵管25 ℃ 的pH 為7.4±0.2。
A.12.2.3 其他各種糖發(fā)酵管: 可按照 A.12.2.2 葡萄糖發(fā)酵管的配制方法制備其他糖類發(fā)酵管。
A.12.3 試驗(yàn)方法
取適量純培養(yǎng)物接種于糖發(fā)酵管,36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)24 h~48 h, 觀察結(jié)果, 藍(lán)色為陰性, 黃色為
陽(yáng)性。
A.13 過(guò)氧化氫試劑
A.13.1 試劑
3%過(guò)氧化氫溶液, 臨用配制。
A.13.2 過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)方法
用細(xì)玻璃棒或一次性接種針挑取單個(gè)菌落, 置于潔凈玻璃平皿內(nèi), 滴加3% 過(guò)氧化氫溶液2 滴, 觀
察結(jié)果。
A.13.3 結(jié)果
于0.5 min 內(nèi)發(fā)生氣泡者為陽(yáng)性, 不發(fā)生氣泡者為陰性。
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GB 4789.30—2025
附 錄 B
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌最可能數(shù)(MPN) 表
每克(毫升) 檢樣中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌最可能數(shù)(MPN) 的檢索見(jiàn)表 B.1。
表 B.1 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌最可能數(shù)(MPN) 檢索表
| 陽(yáng)性管數(shù) | MPN | 95% 置信區(qū)間 | 陽(yáng)性管數(shù) | MPN | 95% 置信區(qū)間 | ||||||
| 0.10 | 0.01 | 0.001 | 下限 | 上限 | 0.10 | 0.01 | 0.001 | 下限 | 上限 | ||
| 0 | 0 | 0 | <3.0 | — | 9.5 | 2 | 2 | 0 | 21 | 4.5 | 42 |
| 0 | 0 | 1 | 3.0 | 0.15 | 9.6 | 2 | 2 | 1 | 28 | 8.7 | 94 |
| 0 | 1 | 0 | 3.0 | 0.15 | 11 | 2 | 2 | 2 | 35 | 8.7 | 94 |
| 0 | 1 | 1 | 6.1 | 1.2 | 18 | 2 | 3 | 0 | 29 | 8.7 | 94 |
| 0 | 2 | 0 | 6.2 | 1.2 | 18 | 2 | 3 | 1 | 36 | 8.7 | 94 |
| 0 | 3 | 0 | 9.4 | 3.6 | 38 | 3 | 0 | 0 | 23 | 4.6 | 94 |
| 1 | 0 | 0 | 3.6 | 0.17 | 18 | 3 | 0 | 1 | 38 | 8.7 | 110 |
| 1 | 0 | 1 | 7.2 | 1.3 | 18 | 3 | 0 | 2 | 64 | 17 | 180 |
| 1 | 0 | 2 | 11 | 3.6 | 38 | 3 | 1 | 0 | 43 | 9 | 180 |
| 1 | 1 | 0 | 7.4 | 1.3 | 20 | 3 | 1 | 1 | 75 | 17 | 200 |
| 1 | 1 | 1 | 11 | 3.6 | 38 | 3 | 1 | 2 | 120 | 37 | 420 |
| 1 | 2 | 0 | 11 | 3.6 | 42 | 3 | 1 | 3 | 160 | 40 | 420 |
| 1 | 2 | 1 | 15 | 4.5 | 42 | 3 | 2 | 0 | 93 | 18 | 420 |
| 1 | 3 | 0 | 16 | 4.5 | 42 | 3 | 2 | 1 | 150 | 37 | 420 |
| 2 | 0 | 0 | 9.2 | 1.4 | 38 | 3 | 2 | 2 | 210 | 40 | 430 |
| 2 | 0 | 1 | 14 | 3.6 | 42 | 3 | 2 | 3 | 290 | 90 | 1 000 |
| 2 | 0 | 2 | 20 | 4.5 | 42 | 3 | 3 | 0 | 240 | 42 | 1 000 |
| 2 | 1 | 0 | 15 | 3.7 | 42 | 3 | 3 | 1 | 460 | 90 | 2 000 |
| 2 | 1 | 1 | 20 | 4.5 | 42 | 3 | 3 | 2 | 1 100 | 180 | 4 100 |
| 2 | 1 | 2 | 27 | 8.7 | 94 | 3 | 3 | 3 | >1 100 | 420 | — |
|
注1 : 本表采用3 個(gè)稀釋度[0.1 g(mL) 、0.01 g(mL) 和0.001 g(mL) ], 每個(gè)稀釋度接種3 管。 注2: 表內(nèi)所列檢樣量如改用1 g(mL) 、0.1 g(mL) 和0.01 g(mL) 時(shí), 表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10 倍; 如改用0.01 g (mL) 、0.001 g(mL) 、0.000 1 g(mL) , 則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增高10 倍, 其余類推 |
